Artikel zur Langlebigkeit

Neues molekulares Werkzeug bearbeitet präzise mitochondriale DNA

ein neues molekulares Werkzeug ermöglicht die präzise Bearbeitung mitochondrialer DNA
  • Präzisionsbearbeitungstechnologien, die die DNA-Bearbeitung im Zellkern revolutioniert haben, waren bisher nicht in der Lage, das mitochondriale Genom zu erreichen.

  •  Ein neuer molekularer Editor kann präzise Nukleotidänderungen in der mitochondrialen DNA vornehmen, die aus einem Bakterientoxin hergestellt wird.

  • Im Gegensatz zur DNA-Bearbeitung im Zellkern erfordert die mitochondriale DNA-Bearbeitung einen zugänglichen Weg für den Transport der RNA zu einem Zielort.
  • Forscher identifizierten ein toxisches Protein des Erregers Burkholderia cenocepacia, das andere Bakterien abtöten kann, indem es direkt auf doppelsträngige DNA abzielt.

Dieser Artikel wurde in den Broad Institute News veröffentlicht:

Das Genom in Mitochondrien – den Energie produzierenden Organellen der Zelle – ist an Krankheiten und wichtigen biologischen Funktionen beteiligt, und die Fähigkeit, diese DNA präzise zu verändern, würde es Wissenschaftlern ermöglichen, mehr über die Auswirkungen dieser Gene und Mutationen zu erfahren. Doch die Präzisionsbearbeitungstechnologien, die die DNA-Bearbeitung im Zellkern revolutioniert haben, konnten das mitochondriale Genom nicht erreichen.

Jetzt hat ein Team am Broad Institute of MIT and Harvard und der University of Washington School of Medicine diese Barriere mit einem neuen Typ eines molekularen Editors durchbrochen, der präzise C*G-zu-T*A-Nukleotidveränderungen in der mitochondrialen DNA vornehmen kann. Der aus einem bakteriellen Toxin hergestellte Editor ermöglicht die Modellierung krankheitsbedingter mitochondrialer DNA-Mutationen und öffnet so die Tür zu einem besseren Verständnis genetischer Veränderungen im Zusammenhang mit Krebs, Alterung und mehr.

Die Arbeit wird in Nature beschrieben, zusammen mit den Co-Erstautoren Beverly Mok, einer Doktorandin des Broad Institute und der Harvard University, und Marcos de Moraes, einem Postdoktoranden an der University of Washington (UW).

Die Arbeit wurde gemeinsam von Joseph Mougous, UW-Professor für Mikrobiologie und Forscher am Howard Hughes Medical Institute (HHMI), und David Liu, Richard Merkin-Professor und Direktor des Merkin Institute of Transformative Technologies in Healthcare am Broad Institute, betreut. Professor für Chemie und chemische Biologie an der Harvard University und HHMI-Forscher.

„Das Team hat eine neue Methode zur DNA-Manipulation entwickelt und damit unseres Wissens zum ersten Mal das menschliche mitochondriale Genom präzise bearbeitet – und damit eine Lösung für eine seit langem bestehende Herausforderung in der Molekularbiologie bereitgestellt“, sagte Liu. „Die Arbeit ist ein Beweis für die Zusammenarbeit in der Grundlagen- und angewandten Forschung und könnte über die mitochondriale Biologie hinaus weitere Anwendungen haben.“

Agens der bakteriellen Kriegsführung

Die meisten aktuellen Ansätze zur Untersuchung spezifischer Variationen in der mitochondrialen DNA umfassen die Verwendung von Zellen von Patienten oder einer kleinen Anzahl von Tiermodellen, in denen Mutationen zufällig aufgetreten sind. „Aber diese Methoden weisen große Einschränkungen auf und die Erstellung neuer, definierter Modelle war unmöglich“, sagte Co-Autorin Vamsi Mootha, Institutsmitglied und Co-Direktorin des Metabolism Program bei Broad. Mootha ist außerdem HHMI-Forscher und Professor für Medizin am Massachusetts General Hospital.

Während CRISPR-basierte Technologien DNA im Zellkern schnell und präzise bearbeiten können, was die Modellerstellung für viele Krankheiten erheblich erleichtert, waren diese Tools nicht in der Lage, mitochondriale DNA zu bearbeiten, da sie auf eine Leit-RNA angewiesen sind, um eine Stelle im Genom anzusteuern. Die Mitochondrienmembran ermöglicht Proteinen den Eintritt in die Organelle, es ist jedoch nicht bekannt, dass sie über zugängliche Wege für den Transport von RNA verfügt.

Ein Teil einer möglichen Lösung entstand, als das Mougous-Labor ein toxisches Protein identifizierte, das vom Erreger Burkholderia cenocepacia hergestellt wurde. Dieses Protein kann andere Bakterien abtöten, indem es Cytosin (C) in doppelsträngiger DNA direkt in Uracil (U) umwandelt.

„Das Besondere an diesem Protein und was uns darauf hindeutet, dass es einzigartige Editieranwendungen haben könnte, ist seine Fähigkeit, auf doppelsträngige DNA abzuzielen. Alle zuvor beschriebenen Desaminasen, die auf DNA abzielen, wirken nur auf die einzelsträngige Form, was die Art und Weise einschränkt.“ Sie können als Genom-Editoren eingesetzt werden“, sagte Mougous. Sein Team bestimmte die Struktur und biochemischen Eigenschaften des Toxins namens DddA.

„Wir erkannten, dass die Eigenschaften dieses ‚bakteriellen Kampfstoffs‘ es ermöglichen könnten, ihn mit einem nicht auf CRISPR basierenden DNA-Targeting-System zu koppeln, was die Möglichkeit eröffnet, Basiseditoren zu entwickeln, die nicht auf CRISPR oder Leit-RNAs angewiesen sind.“ erklärte Liu. „Es könnte uns endlich ermöglichen, präzises Genom-Editing in einem der letzten Bereiche der Biologie durchzuführen, der von dieser Technologie noch unantastbar geblieben ist – der mitochondrialen DNA.“

„Das Biest zähmen“

Die erste große Herausforderung für das Team bestand darin, die Toxizität des bakteriellen Wirkstoffs zu beseitigen – was Liu gegenüber Mougous als „Zähmung des Biests“ bezeichnete –, damit es DNA bearbeiten konnte, ohne die Zelle zu schädigen. Die Forscher teilten das Protein in zwei inaktive Hälften, die nur dann DNA bearbeiten konnten, wenn sie sich vereinten.

Die Forscher banden die beiden Hälften des gezähmten Bakterientoxins an TALE-DNA-bindende Proteine, die eine Ziel-DNA-Sequenz sowohl im Zellkern als auch in den Mitochondrien ohne den Einsatz einer Leit-RNA lokalisieren und binden können. Wenn diese Teile DNA nebeneinander binden, setzt sich der Komplex wieder in seine aktive Form zusammen und wandelt an dieser Stelle C in U um – was letztendlich zu einer C*-G-zu-T*-A-Basenänderung führt. Die Forscher nannten ihr Tool einen DddA-abgeleiteten Cytosin-Base-Editor (DdCBE).

Das Team testete DdCBE an fünf Genen im mitochondrialen Genom in menschlichen Zellen und stellte fest, dass DdCBE präzise Basenänderungen in bis zu 50 Prozent der mitochondrialen DNA einbaute. Zur weiteren Charakterisierung konzentrierten sie sich auf das Gen ND4, das eine Untereinheit des mitochondrialen Enzymkomplexes I kodiert. Moothas Labor analysierte die mitochondriale Physiologie und Chemie der bearbeiteten Zellen und zeigte, dass sich die Veränderungen wie beabsichtigt auf die Mitochondrien auswirkten.

„Dies ist das erste Mal in meiner Karriere, dass es uns gelungen ist, eine präzise Bearbeitung der mitochondrialen DNA vorzunehmen“, sagte Mootha. „Es ist ein Quantensprung nach vorne – wenn wir gezielt Mutationen erzeugen können, können wir Modelle entwickeln, um krankheitsassoziierte Varianten zu untersuchen, zu bestimmen, welche Rolle sie tatsächlich bei Krankheiten spielen, und die Auswirkungen von Medikamenten auf die beteiligten Signalwege zu untersuchen.“

Zukünftige Entwicklungen

Ein Ziel des Fachgebiets wird es nun sein, Editoren zu entwickeln, die andere Arten genetischer Veränderungen in der mitochondrialen DNA präzise durchführen können.

„Ein mitochondrialer Genomeditor hat das langfristige Potenzial, sich zu einem Therapeutikum zur Behandlung mitochondrialer Krankheiten zu entwickeln, und er hat einen unmittelbareren Wert als Werkzeug, mit dem Wissenschaftler mitochondriale Krankheiten besser modellieren und grundlegende Fragen im Zusammenhang mit der mitochondrialen Biologie untersuchen können.“ und Genetik“, sagte Mougous.

Das Team fügte hinzu, dass einige Merkmale von DdCBE, wie beispielsweise das Fehlen von RNA, auch für andere Gen-Editing-Anwendungen außerhalb der Mitochondrien attraktiv sein könnten.

Diese Studie wurde veröffentlicht in Natur im Juli 2020. 



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